这种让你肚子疼的分子机制找到了！西湖Cell论文揭示病菌入侵人体

科学研究有时候就像福尔摩斯破案，面对看不见摸不着的对手，需要大胆假设，小心求证，外加细致入微的观察。

“艰难梭菌”就是陶亮博士的对手之一。这是一种造成医院和社区感染腹泻及肠炎的重要病原体，近年来在全球各地造成了一系列爆发性感染，被美国疾病预防控制中心列为最高级别威胁的耐药病菌。

陶亮对此跟踪研究了9年。从2013年在哈佛医学院做博士后至今，他一直在研究包括艰难梭菌在内的病原细菌与宿主之间的相互作用。简单说，就是解释艰难梭菌如何入侵人体并致病。

现在，他们有了新的重要发现。

最近，西湖大学生命科学学院陶亮团队与施一公团队合作，在《细胞》（Cell）在线发表题为“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile”的最新研究成果，首次揭示了超毒力分支艰难梭菌毒素B的肠道上皮受体——TFPI蛋白。

这意味着，他们发现了艰难梭菌毒素B入侵人体的新“大门”。

△论文截图为什么盯上艰难梭菌？

艰难梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性细菌，因为分离培养比较困难，所以得名“艰难”。它普遍存在于环境中，包括空气、水、土壤、动物和人类的粪便中。而人体肠道内也是一个它适合定居的场所。

艰难梭菌感染之所以如此严重，抗生素的滥用难辞其咎。当长期使用抗生素，破坏人体正常肠道菌群时，艰难梭菌就会乘虚而入，大量繁殖，引发伪膜性肠炎、腹泻、肠穿孔等多种疾病症状，严重时会威胁生命。

过往研究表明，艰难梭菌有5个主要的进化分支，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，其中II型分支由于其强致病性，又被称为“超毒力分支”，是近年来在北美、欧洲等地区造成数次爆发性感染的罪魁祸首。

艰难梭菌会产生三种毒素 ：毒素 A、毒素 B 和二元毒素。其中，毒素B（TcdB）是艰难梭菌致病的关键“武器”，而不同分支产生的毒素B，则又分属不同的亚型（以TcdB1、TcdB2等方式标注）。

它从“另一扇门”入侵人体

此前，陶亮团队关于经典型的艰难梭菌毒素B在肠道上皮细胞中受体的研究工作，获得了业内广泛的关注和认可。他们已经发现了TcdB1、TcdB3、TcdB5重要的宿主细胞受体——FZD蛋白（注，FZD蛋白也是重要的WNT信号通路的受体）。可以简单理解为，他们已经破解了部分TcdB是如何通过 “大门”进入肠道上皮细胞的。

但作为另一大“毒王”，“超毒力分支的艰难梭菌”专有表达毒素B的两种变体（亚型）——TcdB2和TcdB4，均不识别FZD蛋白。

不知道“大门”在哪里，这两种毒素变体又是如何进入细胞中的？

△论文图文摘要

陶亮团队尝试敲除细胞中的FZD蛋白（经典受体），细胞依然对TcdB4高度敏感。他们猜测，一定存在“另一扇门”——即某种未知受体介导了变体的毒素B入侵细胞。

利用一种名为CRISPR/Cas9的基因敲除文库筛选技术，陶亮团队排查出了一系列相关的候选因子，即“怀疑对象”。经过分析后，他们锁定了一个名为组织因子途径抑制因子（TFPI）的蛋白，认为这个存在于细胞表面的蛋白“涉案”可能性最大，很可能就是这两种毒素B变体进入细胞的“另一扇门”。

TFPI就是隐匿已久的新通道

为了验证这一猜想，研究团队思维缜密地设计并进行了各种不同类型的实验。

关键实验之一，敲除TFPI这扇“大门”，看TcdB4是否还能闯入细胞。

TFPI在哺乳动物中存在α和β两种主要的同源异构体，两种形式都具有介导TcdB4进入细胞的能力。由于TFPI全敲除会导致小鼠死亡，研究团队构建了TFPIβ敲除的小鼠。随后对小鼠进行腹腔注射TcdB4进行毒素挑战实验，发现有超过60%的纯合型（TFPIβ‒/‒）小鼠存活了下来。“证明TFPI是TcdB4的关键受体，并且显示了肾脏是全身系统感染下的主要受损器官”，陶亮说。

△TcdB4和TFPI形成复合物的三维结构图

关键实验二，从分子水平直接“看到“毒素和受体的结合。

陶亮团队与施一公团队的李颜颜研究员等开展合作，利用冷冻电镜单颗粒三维重构技术，解析了分辨率为3.1Å的毒素-受体复合物（TcdB4-TFPI）的三维结构。

随后，通过对比， 研究团队对艰难梭菌毒素B进入细胞的路径进行了归类：

• 第一类以TcdB1/3/5为代表，从FZD这扇“大门”进入；
• 第二类主要包含“超毒力分支”的TcdB2和TcdB4，选择通过TFPI这扇“大门”进入。

(A) 毒素-受体复合物TcdB1-FZD2与TcdB4-TFPI的结构比较。(B) 系统进化分析发现TcdB基于受体结合区域差异可分为两大类，分别识别FZD和TFPI。(C) 艰难梭菌分支I、III、IV、V的TcdB识别FZD作为受体，超毒力分支II的TcdB识别TFPI作为受体。

关键实验三，构建“TFPI诱饵”诱捕毒素，看能否保护细胞和实验动物不受伤害。

研究团队构建了一种“TFPI诱饵”——即含有TFPI部分关键区域的可溶性蛋白——来迷惑并诱捕毒素分子。结果发现，无论是在细胞水平还是小鼠模型中，这类“TFPI诱饵”都可以有效阻止超毒力分支艰难梭菌的毒素B的破坏，起到了显著的保护作用。“这不仅进一步证实TFPI是超毒力艰难梭菌的TcdB在肠道上皮中的受体，更预示了可溶性TFPI作为中和蛋白在防治超毒力艰难梭菌感染中的潜在应用价值。”陶亮解释说。

如前文所述，艰难梭菌的特性使其在抗生素治疗时效果较差且复发严重。

而基于受体的靶向开发，比如中和抗体，是一类路线不同的新策略，理论上说靶点更加精准，对人体和环境带来的负面影响也更小。

这项研究对于揭示和理解艰难梭菌感染的致病机制、及梭菌大毒素的进化和工作方式方面有着重要科学意义，并且为超毒力分支菌株引起的艰难梭菌感染的预防和治疗新方法的开发提供了重要的理论依据。

陶亮课题组

西湖大学生命科学学院的陶亮研究员（Lead Contact）和李颜颜研究员（施一公团队）为本文的共同通讯作者。

西湖大学博士后罗建华、博士生杨琦、博士后张晓峰、科研助理张媛媛、博士后万里为共同第一作者。

其它合作作者包括西湖大学的研究员黄晶博士和甄莹博士，博士后占谢超，博士研究生周瑶、贺柳晴、李丹阳，和杭州医学院的研究员金大智博士。

此外还特别感谢波士顿儿童医院/哈佛医学院的董民教授和西湖大学生命科学学院李党生教授在项目进行过程中的支持与讨论。

本课题受到国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、西湖实验室（生命科学和生物医学浙江省实验室）及西湖教育基金会的资助；项目实施还得到了西湖大学生物医学实验技术中心、实验动物中心和高性能计算中心的支持和帮助。

西湖大学微生物宿主交互实验室致力于研究微生物-宿主之间的相互作用方式和内在规律，尤其是从分子、生化、细胞、生信、结构等方面研究重要病原细菌及其致病因子对宿主的影响及作用机制。

西湖大学生命科学学院研究员陶亮近年来以第一和通讯作者在Cell、Nature、Science、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等学科主流期刊上发表多篇学术论文。

实验室目前有多个博士后、博士生和科研助理岗位，方向包括且不限于分子微生物学、生物信息学和微生物组学、微生物遗传学、免疫学、结构生物学、生物化学、细胞生物学等，诚邀各方青年才俊加入、携手共同成长！

论文链接：

https://authors.elsevier.com/a/1elpeL7PXingP

实验室主页

https://tao.lab.westlake.edu.cn/

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