剛剛，2020年諾貝爾化學獎揭曉。法國生物化學家埃馬紐埃爾·沙爾龐捷（Emmanuelle Charpentier）、美國生物學家詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna）因對新一代基因編輯技術CRISPR的貢獻，摘得今年的獎項。
左圖為沙爾龐捷，右圖為杜德納
埃馬紐埃爾·沙爾龐捷生於1968年，現任馬克思·普朗克生物感染研究所主任，同時是瑞典于默奧大學的訪問教授。詹妮弗·杜德納生於1964年，現任加州大學伯克利分校化學及化學工程系教授。
2011年，杜德納開始與沙爾龐捷合作發展CRISPR技術。一年後，兩位女生物學家在《科學》雜誌發表論文並首次指出，CRISPR-Cas9系統在體外實驗中能“定點”對DNA進行切割，顯著提升了基因編輯的效率，為該領域的發展奠定了基礎。兩位科學家被《時代》週刊評為2015年全球最具影響力100人，並收穫了包括生命科學突破獎在內的多項生命科學大獎。
CRISPR-Cas9 基因編輯系統是本世紀最為重要的生物發現之一。2015年，《科學》將它評為年度突破；助力這項技術誕生的科學家們也先後獲得了有“科學界奧斯卡”之稱的“突破獎”（Breakthrough Prize），在分子生物學界影響深遠的“格魯伯遺傳學獎”（Gruber Genetics Prize），以及表彰重大生物醫學突破的“沃倫·阿爾珀特獎”（Warren Alpert Prize）。
在2014年12月的《環球科學》中，《編輯基因：更快、更準、更簡單》一文就對這項技術的作用機制、發展歷程及前景展開詳細介紹。雖然爭議尚存，但毫無疑問，這項在2015年被《科學》雜誌評為“年度科學突破”的新興技術，正在開創一個全新的時代。
撰文 瑪格麗特·諾克斯（Margaret Knox）
翻譯 馬文靜
1973年，斯坦利·N·科恩（Stanley N。 Cohen）和赫伯特·W·博耶（Herbert W。 Boyer）找到了改變生物體基因組的方法，成功將蛙的DNA插入到細菌中。20世紀70年代末，博耶的基因泰克（Genetech）公司對大腸桿菌進行基因改造，使其帶有一個人源基因（這個基因是人工合成的），最後生產出治療糖尿病的胰島素。很快，加利福尼亞州拉霍亞的索爾克生物研究所（Salk Institute for Biological Studies）的科學家培育出了第一隻轉基因小鼠。
基因工程領域取得的這些巨大成就改變了現代醫學的進程。但是，早期的基因改造方法有兩大侷限：不甚精確，並且難以量產。那時，DNA插入基因組的行為是隨機的，科學家只能祈求好運，但願自己能得到一個有用的突變。1990年，研究人員取得了跨越式的進步。他們設計出能在特定位點對DNA進行剪切的蛋白，突破了第一個侷限。但是，每想要修改一段DNA序列，他們都必須設計一個新的蛋白，這種工作非常耗時，並且十分艱苦。
時間終於到了2012年。瑞典于默奧大學（Umeå University）的埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和加利福尼亞大學伯克利分校的珍妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）領導的研究人員報道，他們在細胞中發現了一種遺傳機制，能讓科學家以前所未有的速度編輯基因組，並且過程十分簡單。此後不久，哈佛大學和麻省理工大學的一個課題組運用這種技術，一次性地對細胞基因組的多個位點進行了修改。
這種先進的技術已經加快了基因工程產業的發展，對遺傳學和醫學也有深遠的推動作用。科學家現在只要幾周時間，就能按需定製出經過基因改造的實驗動物，省去了從前一年的工作量與時間。目前，研究人員正在運用該技術，探索艾滋病、阿爾茨海默病、精神分裂症等疾病的治療方法。該技術將生物體的基因修飾過程變得相當簡單與廉價，研究人員和倫理學家甚至開始擔心，這會催生負面效應。
這種技術名叫CRISPR，是“clustered， regularly interspaced， short palindromic repeats”（即成簇、規律間隔的短迴文重複序列）的縮寫。利用這種序列，細菌可以對侵襲過它的病毒產生“記憶”。自從日本科學家20世紀80年代末發現CRISPR之後，科學家就一直在研究這種奇怪的基因序列。然而，直到杜德娜和卡彭蒂耶偶然注意到一種名叫Cas9的蛋白，CRISPR才顯示出它作為基因組編輯工具的巨大潛力。
RNA的力量
2011年，杜德娜和卡彭蒂耶在波多黎各聖胡安的一次科學會議上相識。他們有很多共同點：他們的團隊都在研究細菌防禦病毒入侵的機制；他們都已經確認，細菌可以記住以前入侵過自己的病毒的DNA，以此來識別病毒，當該病毒再次入侵時，它們就會立刻認出“敵人”。
那次會議後不久，卡彭蒂耶和杜德娜決定合作。當時，卡彭蒂耶在於默奧大學的實驗室剛剛發現，鏈球菌似乎會用Cas9蛋白來“搗碎”突破其細胞壁的病毒。於是，杜德娜在伯克利的實驗室，也開始探究Cas9蛋白的作用機理。
很多科學發現的背後都有一連串巧事，CRISPR的故事也不例外。卡彭蒂耶實驗室的剋日什托夫·黑林斯基（Krzysztof Chylinski）和杜德娜實驗室的馬丁·伊內克（Martin Jinek）在毗鄰的城鎮長大，説着同樣的波蘭方言。杜德娜説：“他們開始通過Skype聊天。兩人一拍即合，然後就開始分享數據、討論做實驗的想法。這個項目就這樣正式開始了。”
兩個實驗室的科學家都意識到，他們或許可以用Cas9蛋白來進行基因組編輯。基因組編輯是基因工程中的一種方法，酶是這一過程中的“分子剪刀”，可以剪切DNA。這種酶名叫核酸酶（nuclease），能在特定的位點切斷雙鏈DNA。DNA斷裂後，細胞會對斷裂位點進行修復。有時，細胞中一些人為導入的基因片段，會在修復的過程中插入這些位點。杜德娜和卡彭蒂耶剛開始合作的時候，科學家如果想改變或關閉一個基因，最先進的方法，是定製一種能找到特定DNA位點並對其進行切割的酶。換句話説，每修飾一次基因，科學家都不得不設計一種新的蛋白，專門針對想要修飾的DNA序列。
但杜德娜和卡彭蒂耶意識到，Cas9蛋白——這種鏈球菌用於免疫防衞的酶，會用RNA來引導自己找到目標DNA。為了探測作用位點，Cas9-RNA複合物會在DNA上不停“彈跳”，直到找到正確的位點。這一過程看似隨機，其實不然。Cas9蛋白的每次彈跳，都是在搜索同一段短小的“信號”序列。Cas9會附着到DNA上，檢測鄰近的序列是否和充當嚮導的RNA匹配。這種RNA叫做嚮導RNA（guide RNA，簡稱gRNA），而只有當gRNA和DNA匹配時，Cas9蛋白才會對DNA進行切割。如果能將這套天然的RNA嚮導系統利用起來，研究人員在切割DNA位點時，就不用每次都構建一種新的酶了。基因組編輯可能會因此變得更簡單、更便宜，也更有效。
這個橫跨大西洋的團隊一起對Cas9蛋白進行了幾個月的研究，並且取得了突破。杜德娜還能清楚地記起那個時刻。他們的實驗室坐落在伯克利校園邊緣一個綠樹成蔭的山坡上，對面就是希臘劇院，彼時還在做博士後研究的伊內克一直那裏在對Cas9蛋白進行實驗。一天，他來杜德娜的辦公室討論實驗結果。面對伊內克和黑林斯基一直在討論的一個問題，他們陷入了沉思：在自然界中——也就是在鏈球菌體內，Cas9蛋白倚靠的不是一個，而是兩個RNA，來引導自己尋找DNA上的正確位點。
如果在保留其嚮導功能的前提下，將兩條gRNA整合成一條RNA鏈，結果會怎麼樣呢？如果只需修飾一個RNA序列，研究人員的工作速度將會得到極大的提升。gRNA序列與目標DNA序列之間存在精妙的互補關係，利用這種關係構建一條gRNA，比定製一個核酸酶更容易。
“看着這些數據，我們突然就開竅了——這種事情經常發生，”杜德娜説道，“我們意識到，其實可以將這些RNA分子設計成一條gRNA。一套由一個蛋白質和一條gRNA組成的系統，就足以成為一個強大的基因修飾工具。我打了個寒顫，心想，‘天哪，我要趕快跑到實驗室去，如果這能成功的話……’”
他們真的成功了。結果超出了杜德娜的設想（儘管她本來就抱有很高的期待）。2012年8月17日，當杜德娜和卡彭蒂耶將他們對CRISPR-Cas9的研究成果公諸於眾時，該領域的科學家立刻認識到這一技術的變革性力量，他們都想知道CRISPR-Cas9究竟能做什麼，一場全球性競賽由此拉開序幕。
快速商業化
2013年之前，研究人員一直在嘗試將CRISPR-Cas9應用於植物和動物細胞——它們比細菌要複雜得多。在他們看來，這和復活尼安德特人與猛獁象一樣激動人心。在哈佛大學，遺傳學家喬治·丘奇（George Church）領導的團隊用CRISPR技術來改變人類基因，為疾病的治療提供了多種可能性。
CRISPR-Cas9很快成為了投資的熱點。2013年，杜德娜聯手丘奇、麻省理工學院的張鋒和其他研究人員，共同成立了愛迪塔斯醫藥公司（Editas Medicine），他們獲得了4 300萬美元的風險投資，用以開發一類新的、基於CRISPR的藥物。2014年4月，獲得2 500萬美元投資的CRISPR醫療公司（CRISPR Therapeutics）在瑞士巴塞爾和英國倫敦成立，他們的目標也是開發基於CRISPR的疾病療法。愛迪塔斯醫藥公司和CRISPR醫療公司都需要多年時間，才能開發出相應的療法，然而，實驗室的供貨商們已經在向世界各地的客户銷售可以立即用於動物注射的CRISPR材料，並開始為客户定製經CRISPR改造的小鼠、大鼠和兔子。
2014年，我在一個潮濕的夏日拜訪了位於聖路易斯的SAGE實驗室（SAGE Labs），它是第一批獲准使用杜德娜的CRISPR技術來改造齧齒類動物的公司之一。在那裏，我能親眼見識CRISPR是如何起作用的。SAGE實驗室向大約20家頂級製藥公司，以及眾多高校、研究所和基金會供應實驗材料。英國劍橋的生物技術公司地平線發現集團（Horizon Discovery Group）早前也已獨立涉足CRISPR產品的研發；2014年9月，他們又以4 800萬美元收購了SAGE實驗室。SAGE實驗室位於一個工業園區內，建在一條馬路盡頭的一組低矮的辦公建築裏。這裏的科學家收到一個來自實驗室的網上訂單：加利福尼亞州薩克拉門託（Sacramento）的一個實驗室為研究帕金森病，訂購20只敲除了Pink1基因的小鼠。建築新修的側樓耗資200萬美金，裏面是為客户定製的基因改造大鼠，以及其他經CRISPR改造的齧齒類動物。這些動物生活在超淨、恆温的籠子裏，籠子整整齊齊地放在一起，從地板一直排到天花板。工作人員填寫訂單、選出相應的20只大鼠，將它們輕輕地放在盒子裏打包，然後空運到加利福尼亞——整個流程就是這麼簡單。如果有人想要研究精神分裂症或疼痛控制，也可以這樣訂購實驗動物。
不過，如果倉庫裏沒有客户想要定製的那種動物，流程就不一樣了。例如，有一個客户想要研究帕金森病和一種新發現的可疑基因（或者一個基因的特定突變）之間的關係，當他到SAGE實驗室訂購齧齒類動物的時候，有幾個選擇。SAGE實驗室的科學家能用CRISPR技術“關掉”目標基因，製造一個突變；他們也可以關掉目標基因，然後再往裏插入一個人源基因。從帕金森病到囊性纖維化，再到艾滋病，許多疾病都和基因突變有關。過去，科學家需要一年時間，才能培育出這些帶有複雜基因突變的實驗動物。但CRISPR不同於以往的基因組編輯技術。利用這種技術，研究人員能同時在細胞內快速地改變多個基因。培育基因工程動物的時間已因此縮短到幾周。
SAGE的員工首先使用化學試劑盒，合成客户定製的DNA，以及與這條DNA相匹配的RNA。他們將RNA和Cas9蛋白在培養皿裏混合，一套具有基因組編輯功能的CRISPR工具就誕生了。然後他們會花上大約一週的時間，用一種外形類似於掃描儀的儀器，測試該工具在動物細胞內的功能。這種儀器能夠發射電流，將CRISPR工具注入細胞。進入細胞的CRISPR工具會立刻開始工作，對DNA進行剪切，進行小量的基因插入與刪除。CRISPR並非100%有效：在某些細胞裏，它們會剪切DNA、製造突變，在另一些細胞裏則完全不起作用。為了觀察CRISPR的表現究竟如何，科學家會從細胞中收集DNA，將它們集中起來，並將目標位點附近的dna片段複製多個拷貝。他們會對這些DNA進行處理與分析，然後查看顯示在電腦屏幕上的分析結果。如果CRISPR成功切開目標位點，製造出突變，屏幕上就會顯示出一條模糊的條帶，並且，CRISPR剪切過的DNA越多，條帶就越明亮。
接下來，“戰場”轉移到了側樓的動物實驗室裏。科學家就是在這裏製造出經基因改造的胚胎，以及突變過的齧齒動物。生物學家安德魯·布朗（Andrew Brown）戴着外科手套、身穿藍色的長袍、戴着套鞋和蓬鬆的帽子，彎腰伏在解剖顯微鏡前。他用玻璃移液管的尖端吸起一個大鼠胚胎，然後走到房間的另一頭，將胚胎轉移至另一台裝有機械手臂的顯微鏡上。他將胚胎放到載玻片上的一滴液體裏，固定到枱面上。現在，CRISPR就要發揮它的魔力了：他用右手控制操縱桿，一隻機械手臂將一根空的玻璃針頭扎入胚胎。
從顯微鏡的目鏡看去，胚胎中來自雙親的兩個原核（pronucleus）就像是月球表面的環形山。布朗輕輕推動細胞，直到其中一個原核移到針尖的旁邊。他點擊電腦鼠標，一滴含有CRISPR的液體從針頭噴出，穿過細胞膜進入細胞。原核立即像一朵快速盛開的花一樣膨脹開來。布朗運氣不錯，一個突變細胞就此誕生了。SAGE實驗室中有3個技術員，他們一週4天、一天300次地重複着這項工作。
布朗將完成注射的大鼠胚胎吸入移液管，移進培養皿，存儲在加熱至動物體温的培養箱中。最後，他需要將30~40枚經過修飾的胚胎注射到代孕母鼠體內。20天后，代孕大鼠將懷上5~20個“孩子”，當這些“孩子”長到10天大的時候，SAGE實驗室的科學家將抽取組織樣本，檢測哪個“孩子”帶有改造過的基因。
“這是最令人激動的時候，”布朗説道。20個胚胎中，可能只有1個能被成功改造，而改造成功的動物，就是我們所説的種源動物 （founder animal）。到了這一步，每個人都會慶祝一下。在我們看來，SAGE實驗室的科學家制造RNA、注射胚胎的方法似乎很簡單，很多實驗室也在用同樣的步驟培養基因工程動物。正如SAGE的首席執行官戴維·斯莫勒（David Smoller）説的那樣，這是可以“量產”的基因組編輯技術。
前景與風險
CRISPR已經勇猛地踏上了商業化的征途，研究人員和商人都在為這種技術設想新的商業用途，其中的某些想法甚至有些狂妄。運用這種技術，醫生或許可以在懷孕早期的婦女體內，改造與唐氏綜合徵有關的異常染色體；育種人員可以重新向抗性雜草的基因組中引入對除草劑敏感的基因；我們還可以復活已經滅絕的物種。這當然會讓有些人感到害怕。比如，最近就有一些警告性的頭條報道，將這種技術形容為“扮演上帝的好方法”，或者“瓶中妖”。這些文章擔心，當我們急於擺脱瘧蚊，太想治好亨廷頓病，或者期望“設計”出更好的嬰兒時，我們也可能是在創造一個充滿有害新基因的“侏羅紀公園”。
以哈佛大學研究人員提出的“滅蚊項目”為例。美國伍德羅·威爾遜國際學者中心（Woodrow Wilson International Center for Scholars）的生物安全分析師託德·庫伊肯（Todd Kuiken）認為，戰勝瘧原蟲是一回事，但要消滅這種寄生蟲的載體，卻是完全不同的另一項任務。如果我們的目標是根除瘧疾這種每年感染兩億人、殺死60萬人的疾病，我們就不得不小心，自己是否會製造出10個新麻煩。“我們必須想清楚，‘我們真要這樣做嗎？’如果答案是‘是’，我們有哪些可用的系統？有什麼樣的保障措施？”
科學家正在快速行動，他們希望預見CRISPR技術最可能的危害，並制定應對措施。2014年7月17日，當哈佛大學的團隊發表一篇討論如何用CRISPR消滅瘧蚊的論文時，他們也在呼籲公眾對這一問題進行討論，他們也指出了基因改造在技術與監管上的窘境。該團隊的生物倫理學家讓蒂寧· 倫斯霍夫（Jeantine Lunshof）説：“CRISPR的發展如此迅猛，很多人還沒聽説過這種技術，但是我們確實正在使用它。這是一種新現象。”現在，在伯克利的創新基因組計劃 （Innovative Genomics Initiative） 的框架下，杜德娜正在組建一個團隊，專門討論應用CRISPR的倫理問題。
如果對倫理問題的擔憂，撲滅了人們對CRISPR的熱情，後果將是不可想象的。例如，2014年6月，麻省理工學院的研究人員報道，他們直接從尾部向動物體內注射CRISPR，治癒了患酪氨酸血癥（tyrosinemia，一種的罕見肝臟疾病）的成年小鼠。這種疾病由一種突變的酶引起。研究人員向小鼠體內注射了3種gRNA序列和Cas9蛋白，以及突變基因的正確DNA序列。小鼠的每250個肝臟細胞中，就有1個插入了正確的基因。接下來一個月，被“修正”的肝臟細胞蓬勃生長，最終取代了1/3的病變細胞——這足以使小鼠擺脱上述疾病。2014年8月，坦普爾大學（Temple University）的病毒學家卡邁勒·哈利利（Kamel Khalili）領導的研究人員報道，他們已經用CRISPR在數個人類細胞系中對HIV病毒進行了剪切。
自上世紀80年代起，哈利利一直奮戰在對抗HIV/AIDS的前線。對他來説，CRISPR是場不折不扣的革命。儘管艾滋病治療已經取得了巨大的進步，但今天的藥物僅僅能控制病毒，仍然不能根除疾病。不過，運用CRISPR，哈利利團隊已經徹底從細胞中清除了HIV的完整DNA拷貝，將受感染的細胞轉化了成無病毒細胞。並且，除了“清洗”已經感染病毒的細胞，CRISPR還可以將一段病毒序列整合進未受感染的細胞中，對其進行免疫——正如杜德娜和她的團隊在原始的細菌中觀察到的那樣。你可以將這種手段稱作“基因疫苗”。哈利利説：“這是終極的治療方法，如果你在兩年前問我，‘你能精準地切割人類細胞中的HIV嗎？’我可能會説這非常困難。但現在，我們做到了。”
【來源：新浪滾動】
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