近期，Nature 上發表了一篇題為 “The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing” 的論文，闡釋了現階段研究人員在基因編輯領域面臨的困境。
近年來，得益於生物學的快速發展，基因組編輯技術頻頻走進人們的視線中。作為一種新興治療技術，基因組編輯技術可以治療多種單基因疾病或複雜性疾病，科學工作者們也對它寄予了厚望。尤其是近來序列特異性核酸酶技術的發展，將極大助力於致病基因的清除和內源性突變基因的修復。
值得一提的是，超過 7000 種孟德爾遺傳病，比如鐮狀細胞貧血症和亨丁頓舞蹈症，原則上可以通過修復突變基因來治療。而且一些複雜性疾病或特發性疾病也可以通過靶向特定基因治療，比如年齡相關性黃斑變性疾病中的促血管生成因子或者腫瘤相關的抗原。
早期的基因工程技術只能將外源或內源遺傳物質隨機插入宿主基因組，基因編輯則能定點編輯想要編輯的基因。基因編輯依賴於經過基因工程改造的核酸酶，也稱“分子剪刀”，在基因組中特定位置產生位點特異性雙鏈斷裂（DSB），誘導生物體通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）來修復 DSB，因為這個修復過程容易出錯，從而導致靶向突變。這種靶向突變就是基因編輯。
被譽為 “基因魔剪” 的 CRISPR/Cas9，早已為大眾耳熟。研究人員們可以用它來清除、添加、激活或抑制其他生物體的目標基因，為治療人類疾病提供了廣闊的前景。可是，“童話”真的如聽起來這般美好嗎？
圖丨基因編輯治療疾病路徑（來源：Nature）
實際上，無論是什麼疾病、DNA 序列如何變化，亦或是在體內還是體外進行基因編輯，實驗的成功與否都受到遞送效率的制約。
基因編輯技術已經進入了人體臨牀試驗階段。然而，在完全實現治療性基因編輯的願景之前，研究人員面臨的挑戰也長期存在。過去的幾十年間，在研究如何遞送蛋白質和核酸時，科學人員們發明了多種基因傳遞技術，在基因編輯的過程中發揮了至關重要的作用，包括用於基因治療的腺相關病毒載體和慢病毒載體，還包括用於遞送蛋白質和核酸的脂質納米粒以及非病毒載體。然而，這些載體的傳遞效率較為低下，靶向特異組織的能力不足，同時基因編輯的工具酶也需要得到優化。還有一系列組織特異性和免疫原性等的問題，可謂挑戰重重。其實，大分子的傳遞問題一直以來都是限制核酸療法發展的關鍵瓶頸，對於研究人員來説已經是老生常談了。舉個例子，通過用正常基因取代致病基因來治療單基因隱性疾病的基因療法，最近在治療 B2 型血友病、腺苷脱氨酶缺乏症和 2 型利伯氏先天性黑內障方面取得了臨牀成功。可是，腺相關病毒載體，逆轉錄病毒和慢病毒載體的發展，成為了實驗進程中最大的阻礙。
基因組編輯治療需要在體內或者體外將內切酶導入細胞，而用於基因編輯的酶通常體積較大，並且需要同時將多個大分子導入一個細胞，這給研究人員帶來了不小的挑戰。
一方面，在以病毒為載體的傳遞方式中，一些酶的體積可能會超過載量。儘管腺相關病毒和慢病毒的 DNA 載量足夠支持大部分的基因替代療法（人類蛋白質的平均大小是 375 個氨基酸，即 ±1.2 kb cDNA），還是無法滿足基因編輯的工具酶要求的 ±4.1 kb cDNA，即化膿性鏈球菌中的 Cas9(SpCas9)加上一個嚮導 RNA 編碼基因的大小。通常來説，dCas9 與輔助蛋白融合後還會超過 ±4.1 kb cDNA。
另一方面，涉及到重組介導的 DNA 修復時，供體模板的載量會明顯增加。因此，研究人員不僅需要找到或者設計更小的 Cas9 變體，而且還需要研究出容載量更大的載體。此外，鋅指核酸酶和歸巢核酸內切酶的大小分別只有 2kb 和 0.7kb，也可以用於遞送。
基因組編輯機器的遞送靠許多的病毒載體來完成，包含腺相關病毒（AAV）、慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、仙台病毒和桿狀病毒載體。然而，大多數研究中都使用了 AAV 和慢病毒（見下圖），它們具有互補優勢。
圖 丨遞送分類及詳情（來源：Nature）
儘管前方道路千難萬險，基因編輯的 “童話夢” 也並未就此破碎。現階段，研究人員已經發現了許多頗有成效的方法和目標組織，給治療性基因編輯的發展帶來希望。
體外傳遞
在人類第一個基因組編輯臨牀實驗中，實驗人員先提取 T 細胞，在體外利用帶有鋅指核酸酶的腺病毒載體轉染 T 細胞，使其表達一個抗 CCR5 的鋅指核酸酶。因為艾滋病是通過 CCR5 進入 T 細胞，這樣一來 T 細胞就可以抵禦艾滋病的感染。將被敲除 CCR5 的 T 細胞注射進人體內以後，相較於普通 T 細胞，這些改造後的 T 細胞在停抗 HIV 藥後存活更久，並且大部分受試者的體內艾滋病 mRNA 的循環水平降低了。
AAV 還被用於體外遞送，一個有趣的現象是，當 AAV 介導的基因組編輯在沒有核酸酶的情況下，會用一個 DNA 供體來替代。特別是，Russell 及其同事發現，將構建的供體嵌入到 AAV 基因組中，產生的 HDR 率比對應的供體質粒的 HDR 率高几個數量級。利用這種特性將部分白細胞介素 - 2 受體亞單位 -α(IL2RA)cDNA 插入到小鼠和人類造血幹細胞的相應位點中，隨後能夠使小鼠受體重新增殖 -- 這項工作對治療 X - 鏈接的嚴重聯合免疫缺陷具有意義。
體內傳遞
研究人員在病毒載體方面傾注了很大的心血，特別是用於體內基因編輯的 AAV 和主要的目標組織肝臟。通過 HDR 介導將 cDNA 整合到一個高表達的內源性位點中，可以實現強有力的轉基因表達，研究人員已經用這種策略來治療血友病，通過將 ZFN 介導的相應 cDNA 敲入強表達的白蛋白位點後，肝臟分泌了高水平的因子 VIII 和因子 IX。另一個例子是，在第一個涉及體內基因組編輯的人類臨牀試驗中，將編碼該酶的 cDNA 敲入白蛋白位點後，肝臟中的艾杜糖醛酸 2 - 硫酸酯酶活性達到了潛在的治療水平。
中樞神經系統也是一個很有潛力的基因編輯治療的目標組織，尤其是敲除致病等位基因以後有望治療許多常染色體顯性單基因疾病。舉個例子，最近研究人員已經使用雙載體 AAV 遞送 SpCas9 來阻止突變亨廷頓蛋白的表達，雖然並未增加實驗小鼠的壽命，但減輕了神經中毒和運動障礙。研究人員還進一步推進了嚮導 RNA 的工程化來表達亨廷頓病的等位基因特異性（即敲除突變等位基因的同時保留野生型（WT）等位基因）。
視網膜也是治療性基因組編輯另一個頗有前途的目標組織，特別是考慮到許多單基因視網膜疾病的生物學特性良好，動物模型的可用性，臨牀的短期可實現性，以及由 FDA 批准的 LCA24,52,53 的基因治療產品。致盲疾病 10 型伯氏先天性黑內障中最常見的基因突變會產生一個隱蔽剪接位點，從而破壞 CEP290 蛋白質的表達。一個已經進行到 1 期臨牀試驗的研究是利用雙載體 AAV5 系統來遞送 SpCas9 和兩個 gRNA 來切除人類基因組中的突變。
肌肉萎縮症是另一個備受期待的體內基因編輯目標組織。一些設計巧妙的研究使用雙載體系統一個編碼 SpCas9 和兩個 gRNA 的 AAV8 和 AAV9 系統切除過早出現終止密碼子的肌營養不良症（DMD）外顯子，以治療假肥大肌營養不良症（DMD）。之後，外顯子跳過恢復肌萎縮蛋白的表達，功能接近 WT，顯著增強骨骼肌的功能。還有研究則使用雙 AAV6 載體系統遞送 Cas9 和一個 HDR 供體去交換無義突變的密碼子，以實現期許的體內編輯效率。此外，另有研究在小鼠模型中使用 AAV9 雙載體系統遞送 SaCas9 和兩個 gRNA 治療先天性肌營養不良症，他們切除了一個致病性剪接位點突變，然後恢復了層粘連蛋白α2 基因中的一個外顯子，最終改善骨骼肌組織和功能。
基因編輯的未來，應該何去何從？
近年來，基因組編輯療法取得了喜人進展，從基礎研究到臨牀前開發，再到進入人體試驗，特別是在體外造血幹細胞和 T 細胞的編輯以及體內肝臟的基因組編輯方面，這些都得益於相關的高效遞送方法。
然而，在充分實現基因組編輯的遠大前景之前，還有一些相當艱鉅的挑戰需要克服。
首先是最為詬病的遞送效率低的問題，目前在許多組織中，HDR 修復甚至敲除效率都很低，所以需要更高效率的遞送去補償。其次，還需要能夠容納鹼基編輯、質粒編輯甚至一些核酸酶的高效單載體，或者更加高效的雙載體。最後，需要能夠瞬時表達或擁有快速開關的載體，以避免體內延時表達可能引起的基因毒性和免疫原性。我們需要構建高通量載體，像是利用病毒的定向進化或者非病毒載體的組合化學，都是很好的應對挑戰的工程方法。除了病毒的定向進化，固體脂質納米粒的結合也可以快速提升小分子干擾核糖核酸（siRNA）遞送至肝臟的效率，這些方式也可以加強用於基因修改的酶的傳遞效率。遞送效率低下，將一直作為治療性基因編輯發展的癥結所在。只有攻克了這一難題，基因編輯的美好童話才能得以實現。