這種讓你肚子疼的分子機制找到了！西湖Cell論文揭示病菌入侵人體

科學研究有時候就像福爾摩斯破案，面對看不見摸不着的對手，需要大膽假設，小心求證，外加細緻入微的觀察。

“艱難梭菌”就是陶亮博士的對手之一。這是一種造成醫院和社區感染腹瀉及腸炎的重要病原體，近年來在全球各地造成了一系列爆發性感染，被美國疾病預防控制中心列為最高級別威脅的耐藥病菌。

陶亮對此跟蹤研究了9年。從2013年在哈佛醫學院做博士後至今，他一直在研究包括艱難梭菌在內的病原細菌與宿主之間的相互作用。簡單説，就是解釋艱難梭菌如何入侵人體並致病。

現在，他們有了新的重要發現。

最近，西湖大學生命科學學院陶亮團隊與施一公團隊合作，在《細胞》（Cell）在線發表題為“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile”的最新研究成果，首次揭示了超毒力分支艱難梭菌毒素B的腸道上皮受體——TFPI蛋白。

這意味着，他們發現了艱難梭菌毒素B入侵人體的新“大門”。

△論文截圖為什麼盯上艱難梭菌？

艱難梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽性細菌，因為分離培養比較困難，所以得名“艱難”。它普遍存在於環境中，包括空氣、水、土壤、動物和人類的糞便中。而人體腸道內也是一個它適合定居的場所。

艱難梭菌感染之所以如此嚴重，抗生素的濫用難辭其咎。當長期使用抗生素，破壞人體正常腸道菌羣時，艱難梭菌就會乘虛而入，大量繁殖，引發偽膜性腸炎、腹瀉、腸穿孔等多種疾病症狀，嚴重時會威脅生命。

過往研究表明，艱難梭菌有5個主要的進化分支，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，其中II型分支由於其強致病性，又被稱為“超毒力分支”，是近年來在北美、歐洲等地區造成數次爆發性感染的罪魁禍首。

艱難梭菌會產生三種毒素 ：毒素 A、毒素 B 和二元毒素。其中，毒素B（TcdB）是艱難梭菌致病的關鍵“武器”，而不同分支產生的毒素B，則又分屬不同的亞型（以TcdB1、TcdB2等方式標註）。

它從“另一扇門”入侵人體

此前，陶亮團隊關於經典型的艱難梭菌毒素B在腸道上皮細胞中受體的研究工作，獲得了業內廣泛的關注和認可。他們已經發現了TcdB1、TcdB3、TcdB5重要的宿主細胞受體——FZD蛋白（注，FZD蛋白也是重要的WNT信號通路的受體）。可以簡單理解為，他們已經破解了部分TcdB是如何通過 “大門”進入腸道上皮細胞的。

但作為另一大“毒王”，“超毒力分支的艱難梭菌”專有表達毒素B的兩種變體（亞型）——TcdB2和TcdB4，均不識別FZD蛋白。

不知道“大門”在哪裏，這兩種毒素變體又是如何進入細胞中的？

△論文圖文摘要

陶亮團隊嘗試敲除細胞中的FZD蛋白（經典受體），細胞依然對TcdB4高度敏感。他們猜測，一定存在“另一扇門”——即某種未知受體介導了變體的毒素B入侵細胞。

利用一種名為CRISPR/Cas9的基因敲除文庫篩選技術，陶亮團隊排查出了一系列相關的候選因子，即“懷疑對象”。經過分析後，他們鎖定了一個名為組織因子途徑抑制因子（TFPI）的蛋白，認為這個存在於細胞表面的蛋白“涉案”可能性最大，很可能就是這兩種毒素B變體進入細胞的“另一扇門”。

TFPI就是隱匿已久的新通道

為了驗證這一猜想，研究團隊思維縝密地設計並進行了各種不同類型的實驗。

關鍵實驗之一，敲除TFPI這扇“大門”，看TcdB4是否還能闖入細胞。

TFPI在哺乳動物中存在α和β兩種主要的同源異構體，兩種形式都具有介導TcdB4進入細胞的能力。由於TFPI全敲除會導致小鼠死亡，研究團隊構建了TFPIβ敲除的小鼠。隨後對小鼠進行腹腔注射TcdB4進行毒素挑戰實驗，發現有超過60%的純合型（TFPIβ‒/‒）小鼠存活了下來。“證明TFPI是TcdB4的關鍵受體，並且顯示了腎臟是全身系統感染下的主要受損器官”，陶亮説。

△TcdB4和TFPI形成複合物的三維結構圖

關鍵實驗二，從分子水平直接“看到“毒素和受體的結合。

陶亮團隊與施一公團隊的李顏顏研究員等開展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術，解析了分辨率為3.1Å的毒素-受體複合物（TcdB4-TFPI）的三維結構。

隨後，通過對比， 研究團隊對艱難梭菌毒素B進入細胞的路徑進行了歸類：

• 第一類以TcdB1/3/5為代表，從FZD這扇“大門”進入；
• 第二類主要包含“超毒力分支”的TcdB2和TcdB4，選擇通過TFPI這扇“大門”進入。

(A) 毒素-受體複合物TcdB1-FZD2與TcdB4-TFPI的結構比較。(B) 系統進化分析發現TcdB基於受體結合區域差異可分為兩大類，分別識別FZD和TFPI。(C) 艱難梭菌分支I、III、IV、V的TcdB識別FZD作為受體，超毒力分支II的TcdB識別TFPI作為受體。

關鍵實驗三，構建“TFPI誘餌”誘捕毒素，看能否保護細胞和實驗動物不受傷害。

研究團隊構建了一種“TFPI誘餌”——即含有TFPI部分關鍵區域的可溶性蛋白——來迷惑並誘捕毒素分子。結果發現，無論是在細胞水平還是小鼠模型中，這類“TFPI誘餌”都可以有效阻止超毒力分支艱難梭菌的毒素B的破壞，起到了顯著的保護作用。“這不僅進一步證實TFPI是超毒力艱難梭菌的TcdB在腸道上皮中的受體，更預示了可溶性TFPI作為中和蛋白在防治超毒力艱難梭菌感染中的潛在應用價值。”陶亮解釋説。

如前文所述，艱難梭菌的特性使其在抗生素治療時效果較差且復發嚴重。

而基於受體的靶向開發，比如中和抗體，是一類路線不同的新策略，理論上説靶點更加精準，對人體和環境帶來的負面影響也更小。

這項研究對於揭示和理解艱難梭菌感染的致病機制、及梭菌大毒素的進化和工作方式方面有着重要科學意義，並且為超毒力分支菌株引起的艱難梭菌感染的預防和治療新方法的開發提供了重要的理論依據。

陶亮課題組

西湖大學生命科學學院的陶亮研究員（Lead Contact）和李顏顏研究員（施一公團隊）為本文的共同通訊作者。

西湖大學博士後羅建華、博士生楊琦、博士後張曉峯、科研助理張媛媛、博士後萬里為共同第一作者。

其它合作作者包括西湖大學的研究員黃晶博士和甄瑩博士，博士後佔謝超，博士研究生周瑤、賀柳晴、李丹陽，和杭州醫學院的研究員金大智博士。

此外還特別感謝波士頓兒童醫院/哈佛醫學院的董民教授和西湖大學生命科學學院李黨生教授在項目進行過程中的支持與討論。

本課題受到國家自然科學基金、浙江省自然科學基金、西湖實驗室（生命科學和生物醫學浙江省實驗室）及西湖教育基金會的資助；項目實施還得到了西湖大學生物醫學實驗技術中心、實驗動物中心和高性能計算中心的支持和幫助。

西湖大學微生物宿主交互實驗室致力於研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內在規律，尤其是從分子、生化、細胞、生信、結構等方面研究重要病原細菌及其致病因子對宿主的影響及作用機制。

西湖大學生命科學學院研究員陶亮近年來以第一和通訊作者在Cell、Nature、Science、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學科主流期刊上發表多篇學術論文。

實驗室目前有多個博士後、博士生和科研助理崗位，方向包括且不限於分子微生物學、生物信息學和微生物組學、微生物遺傳學、免疫學、結構生物學、生物化學、細胞生物學等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長！

論文鏈接：

https://authors.elsevier.com/a/1elpeL7PXingP

實驗室主頁

https://tao.lab.westlake.edu.cn/

— 完 —

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