作者|王聰 來源|Bio生物世界(ID：ibioworld)
1976年，德國科學家 HeinzL. Sanger 等人首次發現了circRNA分子，在經過30多年的沉寂後，circRNA在2013年一鳴驚人，並在隨後幾年時間裡迅速成為新一代明星分子。
環狀RNA(circRNA)，是一類非編碼RNA，其特徵在於3'和5'末端透過反向剪接形成共價連線。circRNA長期以來一直被認為是mRNA剪接過程的副產物，沒有特定功能。但近年來，人們在真菌、原生生物、植物、果蠅、小鼠以及人類細胞中發現了許多circRNA。越來越多的研究表明，circRNA並非mRNA剪接的副產物，而是在細胞中發揮重要作用的一類RNA分子。
中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)陳玲玲研究組長期從事長非編碼RNA(包括LncRNA和circRNA)生物學研究，發表了一系列長非編碼RNA重要研究成果。
2020年12月7日，陳玲玲、楊力、李勁松團隊合作，在 Nature Methods 雜誌發表了題為：Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system 的研究論文。該研究於2020年3月25日在預印本 bioRxiv 提前上線。
該研究開發了CRISPR–RfxCas13d，透過gRNA靶向circRNA的反向剪接位點(BSJ)，可有效區分circRNA與線性mRNA。基於該技術，研究團隊構建了靶向人類高表達circRNA的反向剪接位點序列的慢病毒文庫，使用該篩選文庫，研究團隊發現了一組對細胞生長、胚胎髮育等有重要作用的功能性circRNA。
該研究開發了一種基於CRISPR-Cas13d的篩選工具，能夠快速篩選和發現功能性circRNA。
CRISPR-Cas9基因編輯技術自2013年以來，由於強大的DNA編輯能力而備受關注，更是在今年榮獲諾貝爾化學獎。
2013年2月，張鋒團隊首先將CRISPR-Cas9基因編輯技術成功應用與哺乳動物和人類細胞，成功編輯DNA。2016年8月，張鋒團隊發現並證實Cas13a能夠靶向切割RNA。
而此後發現的Cas13d，具有更高的效率、更低的脫靶率，更重要的是，Cas13d相比其他Cas13家族成員具有更小的尺寸，能夠更容易包裝到病毒載體中，因此具有更好的遞送優勢和應用前景。
circRNA通常由編碼基因的外顯子部分反向剪接而來，但由於缺乏區分circRNA與其同源外顯子mRNA的適當方法，目前對特定circRNA的功能仍然知之甚少。
CRISPR-Cas13系統，能否透過gRNA靶向circRNA的反向剪接位點(BSJ)來區分circRNA和其同源線性mRNA尚未可知。
研究團隊分別驗證了LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、RfxCas13d 對特定circRNA敲低效果，試驗結果表明，RfxCas13d對circRNA的敲低效率最高，且對應的線性mRNA幾乎不受影響。
接下來，研究團隊構建了靶向人類細胞中高表達的circRNA的BSJ-gRNA文庫，並在HT29、HeLa、293FT及H9細胞系中進行功能喪失篩選，並對篩選到的circRNA進行單獨功能驗證，結果表現一致。表明使用RfxCas13d/BSJ-gRNA進行人類細胞功能性circRNA篩選是可行的。
使用該篩選工具，研究團隊發現了一組對細胞生長非常重要的circRNA，其中，circFAM120A透過阻止FAM120A的mRNA與翻譯抑制劑IGF2BP2的結合，促進FAM120A表達，在體內和體外增強細胞增殖，起到癌基因的作用。
該篩選工具同樣能夠有效、穩定地干擾小鼠胚胎中的circRNA表達，而不影響對應的線性mRNA，研究團隊使用該篩選工具發現了對小鼠胚胎植入前發育非常重要的circMan1a2，這也表明circRNA在動物早期發育中還有我們未知的功能。
該方法可以在在不影響其母基因mRNA表達的情況下，構建circRNA功能喪失的小鼠模型，這將是證明內源circRNA生理重要性的必要條件。
總的來說，該研究開發了一種基於CRISPR-Cas13d的篩選工具，能夠在個體和大規模水平快速篩選和發現功能性circRNA。
據悉，中科院分子細胞科學卓越創新中心陳玲玲組李斯琪博士、李響博士、中科院上海營養與健康研究所(中科院-馬普學會計算生物學夥伴研究所)楊力組薛尉博士生和中科院分子細胞科學卓越創新中心李勁松組張麟博士生為共同第一作者，陳玲玲研究員、楊力研究員和李勁松研究員為該論文的共同通訊作者。