腫瘤異質性作為癌症生物學最主要的特徵之一，是癌症研究者必須考慮的問題。對處於正常組織背景下的腫瘤而言，可能包含多種不同亞型，這些亞型可能含有各自獨特的突變信息，這種異質性對癌細胞的耐藥性及腫瘤的復發起着關鍵性的作用。
論文第一作者Alexis Guernet突破性地將CRISPR/Cas9技術與生態學中常用的DNA條形碼技術聯用（即CRISPR-條形碼技術），通過在基因組特殊位置插入一系列點突變來標記和追蹤含有特定突變的腫瘤細胞亞型，建立了腫瘤細胞異質性背景下的耐藥模型。研究人員進一步證明發現，CRISPR-條形碼技術不僅能夠實現對多種基因突變的研究，也能實現對致癌驅動突變修復的研究。
研究背景
儘管腫瘤細胞的基因異質性早在數十年前就已被認識[1]，但腫瘤往往被當作一個基因均一的實體來治療[2]。即使基於深度測序為鑑定腫瘤細胞的不同亞羣提供了方法，但不能從實驗上重現基因突變所賦予腫瘤細胞亞羣的進化過程。
CRISPR作為一項基因編輯新技術，已在生物學中得到了廣泛應用。由CRISPR/Cas9引起的雙鏈DNA切口能夠觸發兩種截然不同的DNA修復機制：非同源末端連接途徑（NHEJ）和同源重組（HDR）。儘管同源重組效率低，但其能夠實現DNA的精準編輯[3]，為將HDR介導的基因編輯的低效性轉變為優勢，研究人員採用了沉默DNA條形碼偶聯特定突變的方法，而這些基因標記能夠通過定量PCR所準確讀取來測定基因修飾的細胞與未經基因修飾的細胞的相對含量，該項技術即為CRISPR-條形碼技術。
非小細胞肺癌的耐藥性模型
吉非替尼是一種ATP競爭型可逆性EGFR小分子抑制劑，用以治療非小細胞肺癌，然而易引發耐藥性，這其中半數病例是由EGFR中T790M二級突變引發的[4]。研究人員在PC9細胞中引入了EGFR-T790M條形碼及EGFR-T790T條形碼（對照）（圖1 A-B）。如圖1 C-D所示，吉非替尼對細胞混合羣體的處理能引起EGFR-T790M對EGFR-T790T條形碼比例的上升，即吉非替尼對敏感型細胞（EGFR-T790T）造成了殺傷，而未影響到EGFR-T790M細胞的存活。
結果顯示WZ4002（第三代EGFR非可逆性抑制劑）能夠完全終止吉非替尼條件下EGFR-T790M細胞的富集（圖1 E）。相似地，致癌基因KRAS突變型細胞（G12D）相比於對照組（G12G）在吉非替尼和WZ4002的作用下均產生了富集（圖1 F-G），這一結果顯示以受體抑制為基礎的治療能夠導致替代性耐藥性癌細胞亞羣的選擇。
為單獨研究EGFR激活對細胞入侵能力的影響，EGFR-T790M與EGFR-T790T細胞經吉非替尼處理，使用趨化小室（Boyden chamber）進行研究（圖1 H-I），結果顯示，EGFR-T790M細胞富集於聚碳酸酯膜外側，因而該種突變型細胞具有較強的侵襲能力。
圖1 CRISPR-條形碼技術重現非小細胞肺癌對EGFR抑制劑的耐藥性
A． EGFR-T790M 及 EGFR-T790T條形碼的示意圖；
B． 引物的特異性；
C． 吉非替尼條件下EGFR-T790M與EGFR-T790T條形碼比值的平均值；
D． 含有條形碼的PC9細胞經不同濃度的吉非替尼處理4天；
E． 吉非替尼和/或WZ4002對條形碼比值的影響；
F． 吉非替尼對條形碼比值的影響；
G． WZ4002對條形碼比值的影響；
H． 研究PC9細胞侵襲性的示意圖；
I． 趨化小室膜兩側條形碼的定量PCR分析。
複雜CRISPR-條形碼的體內及體外研究
研究人員將染色體重排後的EML4-ALK片段整合到PC9細胞特定的基因位點中，如圖2 A所示，吉非替尼的處理能誘導EML4-ALK細胞的富集，因此染色體重排可能代表一種全新的EGFR抑制劑的耐藥性機理。
研究人員將上述含有EGFR，KRAS和EML4-ALK突變的PC9細胞混合（即PC9-EKE）（圖2 B）。吉非替尼處理能夠提高含有條形碼的細胞佔比（圖2 C），因此這種複雜模型適用於聯合用藥的評價。如圖2 D所示，儘管WZ4002和ALK抑制劑TAE684能有效防止T790M突變及EML4-ALK融合所賦予細胞的對吉非替尼的耐藥性，但這些藥物對KRAS突變賦予細胞的耐藥性均無作用。這一結果證明，長期而言針對單一耐藥性機制所採取的措施是低效的。
研究人員檢測了曲美替尼（MEK抑制劑）的治療效果，如圖2 E所示，曲美替尼聯合吉非替尼能夠阻斷所有吉非替尼抗性亞型的生長，這一結果證明了不同機制藥物的聯合使用能夠防止或延緩非小細胞肺癌耐藥性的出現。
為闡明該複雜系統在體內研究的應用，將PC9-EKE細胞注射到免疫功能低下的小鼠體內，在吉非替尼的作用下，腫瘤的生長在初期受到了抑制，但在數週之後又恢復了生長（圖3 A）。圖3 B顯示，含PC9-EKE細胞的佔比均顯著上升，但存在個體差異。這一結果表明，腫瘤耐藥性的選擇可能是由攜帶不同突變信息的癌細胞亞型之間的競爭所導致。
圖2 非小細胞肺癌對EGFR抑制劑耐藥性的複雜模型
A. 吉非替尼條件下，含有EML4-ALK條形碼細胞佔比；
B. PC9細胞中複雜CRISPR-條形碼的體內及體外模型；
C. 吉非替尼對PC9-EKE細胞的影響；
D. 吉非替尼聯合WZ4002及TAE684對PC9-EKE細胞的影響；
E. 吉非替尼聯合曲美替尼對PC9-EKE細胞的影響。
圖3 非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的體內耐藥性
A．將PC9細胞注入SCID小鼠，用吉非替尼處理小鼠，測量腫瘤大小；
B．EML4-ALK，KRAS-G12D和 EGFR-T790M 條形碼的含量。
使用高度複雜的CRISPR-條形碼技術探索瘤內異質性
研究人員使用該技術在BT474和PC9細胞的19號染色體的腺相關病毒整合位點（AAVS1）處插入簡併序列。BT474經體外培養和移植入免疫缺陷小鼠中培養，結果顯示樣品中條形碼的分佈是相似的，而且測序結果表明在吉非替尼的作用下，數百基因條形碼產生了富集。PC9-EKE細胞中上調條形碼的程度大於PC9細胞。以上結果證明，在治療開始前耐藥性突變亞型細胞就已經存在。
研究意義
CRISPR-條形碼技術的一個重要優勢在於其可以模擬具有基因異質性腫瘤亞型的複雜羣體，並根據已知機理來評價複雜羣體中基因突變對於耐藥性的影響，因此該項技術成功地模擬了體內腫瘤的複雜環境。該技術是一種快速且高度靈活的多種基因突變檢測技術，在體內外實現了其他方法無法實現的對腫瘤細胞亞型耐藥性的檢測。在條形碼讀取方面，定量PCR、深度測序、數字PCR及Taqman 探針均能用於定量分析，因此該技術使針對癌細胞亞型耐藥性的化合物高通量篩選成為可能。
原始出處
[1] Nowell, P.C. (1976). The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23–28.
[2] Clevers, H. (2011). The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nat. Med. 17, 313–319.
[3] Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2014). Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346, 1258096.
[4] Chong, C.R., and Ja¨ nne, P.A. (2013). The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer. Nat. Med. 19, 1389–1400.
此次會議將邀請在癌症領域具有國際影響力的領軍人物同聚上海，圍繞腫瘤幹細胞異質性、腫瘤微環境異質性、腫瘤遺傳和表觀遺傳突變、腫瘤細胞分型與個體化治療四個方面進行深入的探討，並帶來權威性的知識和經驗。
會議時間：9.15-16日
地點：上海
張嘉斌
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