嘉靖四十年(1561),趙貞吉升遷為户部右侍郎。當時,廷議決定派遣大臣到京師北邊的邊鎮薊州督餉練兵。嚴嵩為了擠趙貞吉,想叫趙貞吉任此職,便設宴招待趙貞吉,並把這個意思告訴了他。明代各邊鎮兵餉的主要來源是民運京運和年例銀。趙貞吉對嚴嵩的安排,既沒有同意也沒有推辭,只是説“前去督餉者,是督察京運還是督察民運?如果是這二運,原來已有專官掌管,再加官沒有什麼益處,只是白白增加煩亂罷了。況且沒有很好訓練士兵的過錯不在於不督餉,即使派出10個户部侍郎去督餉,對於練兵又有什麼益處呢?”嚴嵩聽了趙貞吉的話很不高興,停止了這件事。正趕上嚴嵩休假,吏部任用户部倉場侍郎林應亮督餉。等到嚴嵩返回內閣,聽到這件事非常憤怒。嚴嵩讓言官給事中張益彈劾林應亮,把林應亮調到南京任官,而改用籤都御史霍冀。
張益在嚴嵩的指使下又上奏疏説:“督察軍餉是户部的分內之事,現在朝廷大臣推舉趙貞吉和户部左侍郎劉大賓督餉,他們卻不服從,對督餉一事置之不理,這是不稱職的表現,應該罷免。”於是趙貞吉和劉大賓兩人都被罷官。隆慶初年(1567),趙貞吉被起用任禮部左侍郎、掌管輔導太子的機構詹事府。穆宗巡幸國家最高學府國子監(太學),國子監長官祭酒胡傑講解經史不稱皇上心意被罷免,皇上命令趙貞吉代理祭酒,掌管國子監。趙貞吉講解《大禹謨》一文很稱皇帝心意,皇上命他充任日講官。日講是皇帝接受教育的形式之一,日講官每天進文華殿為皇帝講讀經史。趙貞吉年紀已過60歲,但敢於發表自己的看法,論事説理頭頭是道,皇上對他很有好感。不久,趙貞吉被升遷為南京禮部尚書。趙貞吉已經南下赴任,皇上又思念他,召他回京仍任講官。
隆慶三年(1569)秋,皇上任命趙貞吉兼文淵閣大學士進入內閣,參預機務。趙貞吉入朝謝恩,説:“當今,朝廷紀綱,邊防政務,多有廢馳,需全力整頓。臣進入內閣後,將用畢生精力輔佐皇上。只希望皇上事事自己拿主意,臣按照皇上的旨意辦事。”皇上更加喜歡趙貞吉。當時俺答軍進佔大同,總兵官趙岢打了敗仗,而總督陳其學卻給朝廷送上勝利的捷報,被御史燕如宦所揭發。趙貞吉主張重重地懲罰他們,兵部尚書霍冀卻主張將他們降官貶秩。趙貞吉不能和與自己官職相同人爭論,便給皇上上奏疏説:“邊帥違反軍律,祖宗制定的法律已有論述的規定。現在當事人(指兵部尚書)歪曲祖宗之法庇護犯了軍律的人,這樣做把法律置之何處呢?還有什麼公正呢?老了,沒有辦法再效忠皇上了,望皇上許臣辭官歸鄉吧。”皇上不許,不久趙貞吉被加封為太子太保。
明初,京師禁軍列3大營,每營都設1個將領。嘉靖年間開始到隆慶年間,以1人總領3大營,趙貞吉認為1人總領3大營,權力太大,容易形成擁兵自重的局面,便上奏疏極力指岀其中的弊端,請求把禁軍分成5大營,每營各設一將領,稍微恢復祖宗的舊制。皇上讚賞趙貞吉的建議,命令兵部召集眾朝臣商議。兵部尚書霍冀以前和趙貞吉有矛盾,意見不合,所以對趙貞吉的建議很不以為然。大臣們也多認為強兵在於選擇良將而不在於變更祖宗的規定。霍冀等便上疏説,京師禁軍應和以前一樣設3大營,只是以1人為總督權力太大,應該3營各設1名將軍,把總督廢黜,任用文臣總理各營事務。皇上批准了這一建議。起初,給事中楊鎔彈劾霍冀貪污枉法、辦事平庸。皇上對這封奏彈沒有理會,霍冀仍在兵部尚書任上。霍冀以楊鎔和趙貞吉是同鄉,便懷疑這是趙貞吉指使的,上奏疏解釋後請求辭官,並且極力詆譭趙貞吉。趙貞吉也上疏辮解請求辭官歸鄉。皇上下詔留任趙貞吉,而罷免了霍冀的官職。
從這以後,京營中的制度幾次變更,但沒過一年就恢復了原來的制度,趙貞吉也不能有所爭論。俺答通過邊帥請求朝廷賜給自己一個封號,當皇上把這個問題交給羣臣商議時,趙貞吉極力贊成當初(隆慶三年),高拱再次進入內閣後,皇上就命令他仍掌吏部事。趙貞吉也想以閣臣身份掌管部院等中央機構,他對內閣首輔李春芳提及後,便得以掌都察院事。隆慶四年(1570)二月,皇上任命趙貞吉掌都察院事。都察院是總領監察事務的機構,長官為左、右都御史,品秩正二品。高拱當初是在科道官的奏劾下離開內閣的,這次入閣後便要借考核對科道官進行報復。隆慶四年十月,穆宗對掌吏部事的內閣大學士高拱下了道命令,説:“自朕即位四年,科道官放肆,欺亂朝綱。其中有奸邪不稱職者,卿等考察詳實奏報上來。”這個詔諭出自高拱的預謀。對於科道官“欺亂朝綱”的考察,使科道官感到威脅,懼怕高拱乘機打擊報復,玉石不分。
這時,趙貞吉上疏諫止,他説:“前不久因為御史葉夢熊上疏談論國事觸犯了聖意,陛下嚴令考核科道官。應接受考核的科道官近2百人,其中一定有赤心報皇恩、忠誠於皇上、敢於直言的人。現在以放肆欺亂、奸邪不職考核所有的科道官,臣私下認為,恐怕到考核時,吏部做得太過分,忠邪並斥,玉石俱焚,以至於言路堵塞,士氣低落,這不是國家的幸事啊。”趙貞吉的諫議皇上沒有聽從。趙貞吉揭穿了高拱的陰謀,高拱特別不高興。隆慶四年十月,高拱奏請考核科道官,吏部與都察院共同進行,得到皇上批准。考核科道官時,高拱想除去趙貞吉所倚重的人,趙貞吉也想罷免高拱所倚重的人。於是被罷官的有27人,高拱所怨恨的科道官都在其中。而高拱還不罷休,又唆使親信給事中韓楫彈劾趙貞吉庸橫(平庸驕橫),考察官員時存有私心。趙貞吉上疏爭辯請求辭官,並説:“臣自從掌管都察院以來,僅在考核科道官這件事上與高拱意見不合,並向皇上提出來。
高拱做得其他眾所周知的事情,如壞亂選法,縱肆作奸,臣卻閉口不説,有負臣的職責,臣真是個庸臣啊。像高拱的所作所為,才真可以算作驕橫呢。臣辭官歸鄉後,如果皇上還讓高拱在內閣任職,但不要讓他長久地把持政權,以避免結黨營私。”奏疏遞上後,皇上最終同意趙貞吉致仕,賜馳驛歸。當時是隆慶四年十一月。趙貞吉離閣後,高拱仍以內部大學十的身份掌吏部事,隆慶五年五月接任首輔。趙貞吉學識淵博很有才氣,但他生性耿直容易發脾氣,常常和人發生爭執。對於朝廷重臣,他有時也直呼其名,人們也因此而怨恨他。高拱和另一閣臣張居正的名聲、輩份都居於趙貞吉之後,但受到皇上的進用卻居於趙貞吉之前。他們都恃才驕傲,互不服氣,最終彼此結怨相繼離閣。萬曆十年(1582)趙貞吉去世,朝廷贈少保加官,賜“文肅”諡號。