前兩天看到了記憶，虛假記憶和抑鬱症 - Sparks and Spikes - 知乎專欄 這篇文章，對於 Tonegawa 一系列對於尋找記憶痕跡的文章做出了一些介紹。Tonegawa 在實驗設計和文章寫法上為了吸引讀者的目的，使用了“虛假記憶”等一些説法，但是最重要的，這一系列實驗的目的從科學本質上來説是為了尋找“記憶痕跡”(Engram)，而領域裏對於這個 Engram 到底在哪裏是有爭議的。所以我想更加全面地介紹一下別的理論，來彌補@Han Lu沒有提到的一些方面。
本文前半部分科普，後半部分針對具有一定生物學背景的讀者。大家自行按需求選擇閲讀。
什麼是“記憶痕跡”(Engram)?
現在我們對於“記憶”在生物學上的理論是“突觸生物物理和生物化學的改變”，那麼所謂的“記憶痕跡”(Engram)就是“對於外界刺激，大腦裏相應的生物物理和生物化學變化留下的痕跡”。這個理論背後的想法是，對於一個特定的外界刺激，我們是可以根據大腦組織內部化學和物理性質的改變來定位這個特定事件的記憶儲存在哪些細胞裏。
説到底，就是找到記憶到底存在哪兒?
為什麼要找到“記憶痕跡”(Engram)?
一方面是對現有記憶是物理和化學變化這樣一個理論的支持。另外一方面，科學家們的確想着找到了記憶痕跡，就可以開始改變它們，比如抹去 PTSD 病人那些不好的記憶， 或者植入一些記憶(再也不用花時間背信號通路了!)等這些科幻小説中的常見情節，當然以現在的科學認識和技術手段，這樣的目標還很遠，大家不用激動 / 恐慌。
怎麼知道我們找到了“記憶痕跡”(Engram)?
先來一個非常有趣的實驗(Quiroga. et al, 2005)
發表在 2005 年 Natrue 上：科學家們發現，一些神經元似乎是記人的，不論你是看這個人的名字，還是這個人的照片，甚至是這個人的素描圖，都是同樣的神經元在被激活!不同人所在的神經元(們)並不一樣，所以是具有選擇性的。他們怎麼在人體記錄到這麼高精度的信息呢?是因為被試都是頑固性癲癇患者，只能進行病灶切除術，所以在他們不同腦區埋入了電極，可以記錄神經元的電信號(900+ unit，每個 unit 可以記錄幾個細胞的電活動，分佈在四五個不同的腦區裏)，方便手術切口的定位，所以才有了這樣高精度的研究!
不説廢話，我們來看圖，這是一個病人對於不同圖片的反應，這個 unit 電極被植入在右前部海馬區 (一個 unit 電極可以記錄很少的幾個神經元，我查不到到底是多少個神經元，所以希望有知道的朋友能知會一聲)：
藍色框框裏是各種“哈里·貝瑞”(美國著名演員，第 74 屆奧斯卡最佳女主角獎得主)，51-53 是她電影裏貓女的劇照，96 是寫着她名字的圖片。這些圖片呈現給被試然後記錄他們大腦裏的電極信號(第三行中兩個虛線中間是給被試呈現照片的時間， 紅色的柱狀條是記錄的 spikes 數量)：
紅色的是所有哈里·貝瑞的圖片編號，可以看到，當被試看到哈里·貝瑞的圖片，這一個電極明顯記錄到更多的電信號，而且在其他所給的人物裏，這個電極所在位置基本上都沒有太多電信號(=神經元)的活動。(當然，我們不可能給被試看盡人間所有人，所以很難確定這個神經元除了哈里·貝瑞，到底還存沒存第二個人。而這個實驗裏，他們記錄的 900+ 電極裏，只有這個是特定相應哈里·貝瑞的。)
我只想説，這個實驗實在是太酷了!!!就算換照片，換成素描畫像，換成寫着名字的圖片，不論視覺信號怎麼變，我們都能從概念上和一個人連起來!而且她穿着貓女衣服的劇照也能被認出來，而別的演貓女的演員就不能讓這幾個神經元激活!教大家一個撩妹技能，可以深情看着她説：我的部分神經元只為你一人而發放
那麼我們可以説找到了“哈里·貝瑞”的記憶痕跡嗎?
還不能。這些神經元可能只是“哈里·貝瑞”記憶痕跡中的一部分。畢竟我們沒法同時給大腦每一個神經元插個電極記錄它們的電信號。科學家們人為定義了四個標準來判斷有沒有找到“記憶痕跡”：
1)找到學習能夠改變的分子(們)，和相應的一部分特定神經元細胞和功能層面上的改變
2)阻止這些分子 / 細胞層面上的改變能夠阻止記憶的形成。
3)在一部分神經元里人為誘導這些分子 / 細胞層面的改變能夠創造出記憶
4)這些分子 / 細胞層面上的改變要符合神經迴路的邏輯，並且能夠切實地改變行為上的輸出
我們對於這個“分子 / 細胞”層面的改變還一無所知，爭論不休，所以還不能説我們找到了 Engram。
那麼“記憶痕跡”(Engram)可能在哪?
這就是分歧的來源了。Tonegawa 堅定地認為 Engram 只存在在海馬(一個跟空間記憶相關的腦區，下圖中藍色部分)裏(Ramirez. et al, 2013)。而其他科學家，比如 Mark Mayford 則認為 Engram 是存在在大腦皮層的(大腦外面這一大圈)，可能 + 海馬的(Cowansage. et al, 2014)。兩個人用了差不多的實驗設計，Tonegawa 實驗設計和結果可以參看記憶，虛假記憶和抑鬱症 - Sparks and Spikes - 知乎專欄，我不重複介紹，Mayford 用的化學而不是光遺傳的方法，得到的結果卻是 Engram 可能在皮層裏。感興趣的可以看後面乾貨，想看科普的到這就結束了。
希望大家明白，科學界對於 Engram 的位置並沒有一致的看法。難點在於怎樣對整個大腦做生物物理或者生物化學的分析，現代技術都有這樣那樣的缺陷，還不能給出滿意的精度去説我們已經找到了 Engram。
很多詞翻譯起來實在困難，所以這部分只寫給有一定科學背景的讀者，可以進行一些實驗設計細節的探討。
Mayford 用了 DREADD 而 Tonegawa 用了 ChR2，兩個人用的老鼠都是一樣的，這個老鼠是 Mayford 做的，但是實驗結果卻大相徑庭。我會比較一下 DREADD 和 ChR2 兩者優劣，行為學實驗設計上基本一樣，就沒啥好多説的。兩個人相愛相殺，各執一詞，只能看官各自決定了。
先來説下老鼠，Mayford 想要只 mark 那些在被激活的神經元，現在常用的就是 IEG transcription factor，這些 factor 可以快速表達(分鐘)，可以快速 turnover(小時)，常用來 mark 被激活的神經元。比如 cFos, zif268, arc。所以他們用 cFos 做 promoter，induce tTA，這個基因可以結合激活 TetO promotor 從而激活 TetO promotor 後面跟的 gene。而這個 tTA，可以用一個化學藥物抑制，叫 Doxycycline(簡稱 Dox)。這個 Dox 平時可以混在老鼠食物裏喂着，這樣 Dox 會結合 tTA 讓它不能去結合 tetO 也就不能表達跟在後面的基因了。而實驗中，老鼠停喂 Dox，這樣那些激活的神經元因為表達了 cFos，表達了 tTA，沒了 Dox 阻擋，tTA 結合 tet O 就只在這些激活的神經元裏表達了下游基因(Mayford 實驗裏是 hM3Dq，而 Tonegawa 實驗裏是 ChR2)。兩人設計分別如下圖所示(Garner. et al, 2012; Ramirez. et al, 2013)。
那麼 hM3Dq 和 ChR2 又分別是什麼呢?
這些都是可以人為激活神經元的手段。前一種叫 Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drug (DREADD)，後面一種大家叫 Optogenetics。DREADD 需要給老鼠注射一個叫 CNO 的藥，通過 Gq coupled receptor 可以使細胞去極化。注射到成功激活神經元大概是分鐘 - 小時;Optogenetics 就只需要在老鼠大腦裏插入一個 fiber 可以把光照進去，這種手段可以在毫秒級別上激活神經元。自從光遺傳發明瞭以後，越來越多的人用這個手段，看重的就是這個時間上的低延遲，還有就是大家對需要再往老鼠裏面注射一種藥 CNO 的 DREADD 的作法表示謹慎。當然 DREADD 也有優勢，比如 ChR 有的時候不能在你感興趣的地方表達，擔憂光不能 penetrate tissue 等。他們兩個人用的 hM3Dq 和 ChR2 都是激活神經元的，兩種手段裏都有別的受體可以用來抑制神經元。
剛提到了表達的問題，我們來看一下表達 pattern：
所以 cFos-hM3Dq 是 universally 表達的，這樣你可以 tag 所有腦區裏在行為學中被激活的神經元。而 Tonegawa 實驗設計是使用 AAV virus 只在 DG 這個海馬下屬的區域裏表達 ChR2：
問題就來了，AAV virus 最怕就是 leaky，這樣你以為自己只在某個地方表達了 ChR2，其實可能到處都是。Mayford 實驗室的人説，他們老闆自己親自根據 Tonegawa 實驗室 protocol 重做了這個 virus，然後發現非常 leaky，反覆試驗都沒能得到相同的結果。但是生物實驗重複性差很常見，你手裏不 work 不一定能説別人手裏也不 work，所以他們也很無奈。我自己沒有親自做過，所以也不能妄加評斷。但是如果這個 virus leaky，那麼 Tonegawa 組所説的 Engram 就在海馬裏的論斷就可能沒那麼強了。
對 Tonegawa 別的我不能評價，但我要説他們那篇轟動一時的 13 年 Nature 裏用了人家 Mayford 組做的老鼠，連個致謝都不給，有點兒不夠意思。(我不是 Mayford 組裏的人，不是偏心眼啊。)畢竟是諾獎，而且他們用這個 virus 一連灌了好幾篇 Nature 聲稱找到了 Engram 而且就在海馬裏，導致 Mayford 組文章沒有受到平等地考量。
Reference 裏有 Mayford 組 14 年發在 Neuron 上的文章。這個時期他們也已經從 DREADD 換到 opto 了。文章裏為了證明 Cortex 自己就足夠喚起記憶，他們在海馬注射了 NMDA 受體拮抗劑 + 鈉離子通道的拮抗劑 TTX，兩者的組合可以很大地影響記憶。他們發現在這些老鼠裏還是可以通過激活 Cortex(具體來説是 RSC，一個和海馬相連的皮層區)引發老鼠的恐懼記憶。
當然公説公有理，婆説婆有理，兩個組實驗設計上其實都還是很巧妙的，也都有一定的證據支持自己的論點。Tonegawa 當年那篇 Nature 也是驚豔了我，尤其是行為學上很巧妙的設計，讓我激動了好久。期待他們各自組裏的進展!
Reference :
1. Quiroga, R.Q., Reddy, L., Kreiman, G., Koch, C., and Fried, I. (2005). Invariant visual representation by single neurons in the human brain. Nature435, 1102–1107.
2. Drane, L., Ainsley, J.A., Mayford, M.R., and Reijmers, L.G. (2014). A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Front Mol Neurosci 7, 82.
3. Garner, A.R., Rowland, D.C., Hwang, S.Y., Baumgaertel, K., Roth, B.L., Kentros, C., and Mayford, M. (2012). Generation of a synthetic memory trace. Science 335, 1513–1516.
4. Ramirez, S., Liu, X., Lin, P.-A.A., Suh, J., Pignatelli, M., Redondo, R.L., Ryan, T.J.J., and Tonegawa, S. (2013). Creating a false memory in the hippocampus. Science 341, 387–391.
5. Cowansage, K.K., Shuman, T., Dillingham, B.C., Chang, A., Golshani, P., and Mayford, M. (2014). Direct reactivation of a coherent neocortical memory of context. Neuron 84, 432–441.